多肽合成：二硫鍵形成

二硫鍵是很多蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中不可或缺的組成部分。我們幾乎可以在所有的胞外肽類和蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)這些共價鍵。當(dāng)一個半胱氨酸的硫原子與位于蛋白質(zhì)不同位置的另一半胱氨酸的硫原子形成共價單鍵時，一個二硫鍵就形成了。這些鍵有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，特別是那些從細(xì)胞中分泌的蛋白質(zhì)。

一個二硫鍵的有效形成涉及多方面，包括對半胱氨酸的恰當(dāng)管理、對該氨基酸殘基的保護(hù)、保護(hù)基團的脫除方法和配對方法等。

如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡單的。多肽經(jīng)固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進(jìn)行氧化。

當(dāng)需要形成2對或2對以上的二硫鍵時，合成過程則相對復(fù)雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的 后階段完成，但有時引入預(yù)先形成的二硫化物是有利于連合或延長肽鏈的。使用 廣泛的Cys的保護(hù)基團有Bzl、Meb、Mob、tBu、Trt、Tmob、TMTr、 Acm、Npys等。

S-acetomidomethyl（Acm）在酸和堿中都非常穩(wěn)定，因此，Acm與Boc和Fmoc化學(xué)成份都是兼容的。一些保守的半胱氨酸殘基對蛋白-蛋白結(jié)合和蛋白-蛋白相互作用至關(guān)重要。部份研究利用Ala替換Cys來破壞二硫鍵結(jié)構(gòu)。另外還可以利用Acm修飾Cys，這種修飾會阻止二硫鍵的形成，同時還保持蛋白中Cys的結(jié)構(gòu)。

S- Acm經(jīng)溶液如醋酸汞（(Hg[OAc]2）在pH 4.0的緩沖液中處理1h后可被去除，從而可獲得自由巰基。或被S-Acm-阻斷的多肽可以在苯甲醚存在下，以TFA作為溶劑，經(jīng)三氟甲烷磺酸銀在0℃處理1h。而在固相合成過程中，當(dāng)多肽仍然錨定在支撐物上時，經(jīng)Hg(OAc)2 (0.06M)在DMF中于20℃避光條件反應(yīng)3小時即可，隨后用DMF和DMF-β-巰基乙醇（9:1，v/v）洗滌，將Hg2 +從被解塊的肽-樹脂中去除。

為什么半胱氨基（Cys)如此特殊?

• Cys的側(cè)鏈有一個非常活躍的反應(yīng)性巰基。此基團中的的氫原子可很容易地被自由基和其他基團取代，因而易與其他分子形成共價鍵。
• 二硫鍵是許多蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的重要組成部分。二硫橋鍵可降低肽的彈性、增加剛度，并減少潛在構(gòu)象的數(shù)量。這樣的構(gòu)象限制對生物活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來說是至關(guān)重要的。它的替換對蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)來說將可能是戲劇性的。
• 疏水性氨基酸如Leu、Ile、Val是螺旋的穩(wěn)定劑。因為即使半胱氨酸沒有形成二硫鍵也可以使α螺旋穩(wěn)定。即如果所有的半胱氨酸殘基處于還原態(tài)（-SH，攜帶自由巰基），高百分比的螺旋片段將有可能。
• 半胱氨酸形成的二硫鍵對三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定來說是持久的。在大多數(shù)情況下，鍵間的S-S橋?qū)π纬伤募壗Y(jié)構(gòu)是必須的。有時形成二硫鍵的半胱氨酸殘基在 結(jié)構(gòu)中相距甚遠(yuǎn)。
• 二硫鍵的拓?fù)涫欠治龅鞍踪|(zhì) 結(jié)構(gòu)同源性的基礎(chǔ)。位于同源蛋白的半胱氨酸殘基是非常保守的。僅色氨酸在統(tǒng)計學(xué)上比半胱氨酸更為保守。
• 半胱氨酸位于巰基酶催化部位的中心。半胱氨酸可直接與底物形成酰基中間體。還原形態(tài)作為“巰基緩沖器”維持著蛋白中的半胱氨酸處于還原態(tài)。在低的pH值時，平衡偏向還原態(tài)，-SH形式，而在堿性環(huán)境下，-SH更傾向于被氧化，形成-SR，而 R是除氫原子外的任何物質(zhì)。
• ? 半胱氨酸也可作為解毒性與過氧化氫和有機過氧化物反應(yīng)。

多重二硫鍵形成方案