細胞介紹

該細胞系來自15歲男性白人的組織。形態為上皮形，模式染色體數為55，在免疫抑制小鼠中不致瘤。

細胞特性

1） 來源：肝細胞癌

2） 形態：上皮細胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完全培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。  收到細胞后**次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備MEM 培養基；上等胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

培養注意事項：1. hepg2細胞復蘇或傳代后會有少部分的細胞貼壁和部分懸浮的細胞，復蘇兩天后細胞會從貼壁細胞向外開始生長，有時****長過程中，細胞會再貼壁細胞的上方生長，形成不同的細胞層，這種情況會有發生。 在細胞復蘇的一周內，培養瓶中 通常會有懸浮的活的細胞團，在換液過程中不要丟棄在這些活的懸浮細胞，可以通過離心（125×g）回收細胞，重新打回到培養瓶中，分離或者丟棄漂浮的活細胞會使細胞數量變少，引起細胞的停滯生長或細胞死亡。

2.培養條件的細微變化，尤其是pH和培養基中血清的質量，可能會影響細胞的生長狀況，在細胞的生長過程中會有細胞內的液泡出現，特別在細胞快要融合是會出現這種情況。培養細胞時使用未被滅活的高質量、低內毒素的胎牛血清，可以使細胞更好的貼壁和形成單層細胞。

3. 細胞在生長過程中可以通過將血清濃度提到到20%來改善細胞生長緩慢的情況。（參考atcc 有關該細胞的描述）

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1）凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。**天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達70%-90%，即可進行傳代培養。

該細胞為輕微貼壁和少量懸浮培養細胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3） 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。